Protocolo de extracción de ADN en Gallinas

 Las aves, a diferencia de los mamíferos, tienen los glóbulos rojos con núcleo y, por lo tanto, con ADN. Además, su sangre coagula rápidamente.


Puede ser por estos dos motivos o por el segundo, que los kits comerciales para la extracción de ADN no funcionaron en la Gallina de Chulilla. Sin embargo, con un protocolo clásico de extracción de ADN, que ya se probó en anguilas, se consiguen resultados muy positivos en cuanto a concentración y calidad del ADN.

PROTOCOLO

1.- Preparar, por cada muestra de sangre, un tubo de 15 ml con 3 ml de Tampón de Lisis I
Para 100 ml de Tampón de Lisis I
-        Tris-HCL 0,1M pH 8,0: 10 ml de 1M
-        EDTA 0,1M pH 8,0: 20 ml de 0,5M
              Para 100 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0:                       
                       18,62 g de EDTA (Ácido etilendiamintetraacético sódico, C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈, Pm=336,21) 
                        2 g de Na OH.        
                        Disolver con agitador y ajustar pH a 8,0 y enrasar a 100 ml.
-        H₂O mili-Q estéril: 70 ml


2.- Añadir 40 microlitros de sangre entera dentro del tubo y pipetear varias veces para limpiar el interior de la punta y obtener una suspensión homogénea.


3.- Añadir 3 ml de Tampón de Lisis II con mucho cuidado, dejándola resbalar por la pared del tubo. Cerrar con tapón e invertir 25 veces (sin prisas)

Para 100 ml de Tampón de Lisis II
-        Tris-HCL 0,1M pH 8,0 : 10 ml de 1M

-        EDTA 0,1M pH 8,0 : 20 ml de 0,5M

-    SDS al 1% : 10 ml al 10%

            Disolver 50 g de SDS (Dodecil Sulfato Sódico, CH₃(CH₂)₁₁OSO₃Na, Pm = 288,38) 

            en 400 ml de H₂O bidestilada

            Ajustar el pH a 7,2. Enrasar a 500 ml

-        H₂O mili-Q estéril : 60 ml

4.- Añadir 40 microlitros de Proteinasa K y 320 microlitros de solución de Precipitación. Cerrar el tapón, invertir 25 veces e incubar toda la noche a 55ºC.
Solución de Precipitación: solución saturada de NaCL (6M)
-  Cloruro sódico (NaCl, Pm = 54,44) : 100 g.
-  Agua bidestilada --> 200 ml.
-  Esterilizar en autoclave 

-o-o-o-o- incubar toda la noche -o-o-o-o-

5.- Añadir 1,6 ml de solución de precipitación y mezclar en vórtex durante 20 segundos (asegurarse de hacer un remolino en todo el tubo)


6.- Incubar en hielo durante 10 minutos (opcionalmente, mezclar por inversión 25 veces, ya que esta etapa es muy crítica para la precipitación de las proteínas)


7.- Centrifugar a 3000 rpm durante 30 minutos a 4ºC.


8.- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos a 4ºC.


9.- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml y añadir 6 ml de Isopropanol (CH₃CHOHCH_3, Pm = 60,10). Invertir el tubo 25 veces e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

¡¡Momento mágico!!

En este paso, a la 3ª o 4ª vez de invertir el tubo, se aprecia la hebra de ADN... 

¡podrás observar una "maraña" blanca!

10.- Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Eliminar el sobrenadante con cuidado de no perder el pellet.


11.- Añadir 10 ml de Etanol (CH₃CH₂OH, Pm = 46,07) al 70% a 0ºC. Invertir el tubo varias veces para lavar el pellet.


12.- Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos a 4ºC y con mucho cuidado eliminar el sobrenadante. Colocar el tubo invertido en una posición inclinada sobre una toallita de papel absorbente hasta que se seque el pellet.


13.- Resuspender el pellet en 500 ml de TE y transferir a un eppendorf estéril
TE: Tampón de Elución. Para 500 ml de TE pH 8,0
-  Tris-HCl 0,1M pH 8,0 --> 5 ml.
-  EDTA 0,5M pH 8,0 --> 1 ml.
-  H₂O bidestilada --> 494 ml.
-  Ajustar el pH y esterilizar en autoclave.


14.- Almacenar la solución de ADN a 4ºC